Studii privind diferențierea in vitro a celulelor stem mezenchimale spre linia adipocitară și validarea factorilor moleculari implicați în adipogeneză

Obiective generale: (1) determinarea metodelor și condițiilor optime prin care celulele stem mezenchimale adulte pot fi induse să se diferențieze spre linia adipocitară; (2) definirea și validarea mecanismelor moleculare de control implicate în diferențierea MSC spre adipocite.

Obiective specifice: (1) optimizarea metodelor de obținere, izolare și cultivare a celulelor stem mezenchimale adulte umane din măduva osoasă hematogenă în vederea inducerii diferențierii spre linia adipocitară; (2) evidențierea modulatorilor externi ai diferențierii adipocitare, de la inducere la diferențiere terminală; (3) verificarea diferențierii adipocitare prin metode imunohistochimice și de biologie moleculară; (4) evaluarea și corelarea rezultatelor obținute din perspective integrării informaționale în contextul dezvoltarii obezității; (5) investigarea factorilor implicați în controlul transcripțional al genelor adipocitare în timpul diferențierii; (6) verificarea eficienței inhibiției procesului de diferențiere a MSC spre linia adipocitară; (7) validarea și optimizarea protocoalelor de transfecție utilizate pentru inhibarea adipogenezei; (8) elaborarea unui concept teoretic cu privire la mecanismele complexe implicate în apariția obezității

Din perspectiva creșterii prevalenței obezității în întreaga lume, chiar și în rândurile copiilor, proiectul de față a propus o abordare sistematizată a factorilor moleculari implicați în diferențierea celulelor stem mezenchimale spre linia adipocitară. După recoltarea măduvei osoase hematogene umane și izolarea MSC au fost facuta dezvoltarea unor protocoale optime de diferențiere, folosind agenți inductori și de menținere ai adipogenezei. Diferențierea adipocitara a fost verificată prin metode imunohistochimice și de biologie moleculară specifice, ulterior stabilindu-se genele implicate în procesul de adipogeneză prin tehnica microarray. Identificarea markerilor moleculari implicați în adipogeneză, în special în fazele timpurii ale diferențierii MSC umane spre pre-adipocite, deschide perspective practice importante pentru abordările terapeutice ulterioare în tratamentul obezității. Odată identificați acești markeri și stabilită expresia genică implicată în adipogeneză, se vor putea identifica metode moderne de inhibare a procesului de formare a țesutului adipos, țintind la nivel molecular. Până în prezent nu sunt foarte clar identificate genele care reglează adipogeneza, mai ales în ceea ce privește fazele timpurii ale acestui proces. În acest sens, am folosit o tehnică de transfecție modernă, care utilizează microARN (miARN). Am identificat prin tehnici de microarray genele care codifică procesele de adipogeneză în diferite etape. După stabilirea mARN de interes, acesta a fost interferat cu miARN prin procesul de gene-silencing, urmând să identificăm genele cheie utilizate în etapele ulterioare. În final, am generat o harta genică si am elaborat un concept teoretic cu privire la mecanismele complexe implicate în apariția obezității.

Din punct de vedere al rezultatelor semnificative generate de acest proiect, considerăm relevantă realizarea modelului conceptual pentru identificarea şi analiza genelor implicate în adipogeneză, atât în etapa de pre-adipogeneză, cât şi pentru adipocitele mature. Prin tehnica de microarray s-au identificat genele care intervin în reglarea procesului de adipogeneză, care au fost clusterizate, interes deosebit prezentând genele implicate in metabolismul lipidic. Din multitudinea de gene up şi down-regulate au fost selectate genele de interes, care au fost inhibate prin utilizarea unor secvenţe specifice de siRNA – PPARγ, ALOXB15, c-myc. Totuşi, datele obţinute prin metode chimice, de tipul GC-MS, au arătat că adipocitele diferenţiate in vitro din celule stem mezenchimale nu prezintă aceeaşi compoziţie a acizilor graşi liberi, ceea ce face ca modelul de diferenţiere in vitro să ducă la apariţia unor celule imature, cu funcţie alterată. Cu toate că fenomenul de interferenţă (siRNA) duce la inhibarea diferenţierii MSC spre linia adipocitară, mai ales dacă se realizează la nivelul pre-adipocitelor, se pune sub semnul întrebării capacitatea MSC de a se diferenţia spre celule funcţionale. Rezultatul final al acestor invetigaţii a fost stabilirea hărţii genice pentru adipocitele diferenţiate din celulele stem mezenchimale umane.

• Model conceptual pentru identificarea diferitelor grupe de gene implicate în adipogeneză
• Protocol de identificare genică prin tehnica microarray
• Protocol de obținere a miARN
• Model conceptul/protocoale de transfecție
• Harta genică a principalelor gene adipocitare 

1. Bojin F, Cristea M, Ordodi V, Anghel S, Tanasie G, Panaitescu C, Paunescu V. Differences between stromal stem cells from various tissular sources – morphological and functional studies. Romanian Journal of Biochemistry, 2011; 48(suppl.): 30 – The Annual International Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, The Conference on “Cellular and Molecular Biotechnologies on Medical Applications”, 28-30 September, Craiova, Romania.
2. Ordodi V, Bojin F, Gruia A, Boleman A, Gavriliuc O, Cristea M, Anghel S, Tanasie G, Panaitescu C, Paunescu V. Mesenchymal stem cells as model of in vitro adipogenesis. Fiziologia-Physiology, 2011; suppl: 55 – 41^st Annual Immunology Conference, 22-24 September, Timisoara, Romania.
3. Bojin F, Gavriliuc O, Tatu CA, Ordodi V, Cristea M, Gruia A, Anghel S, Boleman A, Crisnic D, Tatu C, Tanasie G, Panaitescu C, Paunescu V. Genetic changes during adipocytes ontogenesis. VI^th Academician Nicolae Cajal Symposium, Bucharest, March 30-April 01 2011, Abstract book pg. 19.
4. Bojin F, Gavriliuc O, Tatu CA, Cristea M, Anghel S, Crisnic D, Nistor D, Tatu C, Tanasie G, Panaitescu C, Paunescu V. In vitro adipogenic differentiation pathway. The XXVth National Conference of Romanian Society of Physiological Sciences, 26-28 May 2011, Tg. Mures, Romania
5. Paunescu V, Bojin F, Gavriliuc O, Tatu CA, Ordodi V, Rosca A, Cristea M, Gruia A, Anghel S, Nistor D, Crisnic D, Tatu C, Tanasie G, Panaitescu C. Multipotent stromal cells of different origins: insights on in vitro characteristics. Fiziologia-Physiology, 2011; suppl: 33 – 41^st Annual Immunology Conference, 22-24 September, Timisoara, Romania.
6. Bojin MF, Gavriliuc O, Tatu CA, Bunu C, Paunescu V. Tumor-associated fibroblasts recapitulate in vitro adipogenic differentiation pathway. Obesity Reviews 2010; 11th International Congres on Obesity, 11-15 July, Stockholm, Suedia – Abstract Book, pg. 92-93.
7. Bojin F, Tatu CA, Gavriliuc O, Boleman A, Gruia A, Cristea M, Anghel S, Nistor D, Tatu C, Tanasie G, Bunu C, Paunescu V. Adipocytes-induced changes in tumor microenvironment and cancer cells behavior. Immunology and Clinical Allergology Joint Meeting, 28 April-1 May 2010, Sibiu, Romania – Abstracts, pg. 30, ISBN 978-973-88744-3-5.
8. Bojin FM, Tatu CA, Gavriliuc O, Ciuculescu F, Cristea M, Rosca A, Anghel S, Gruia A, Crisnic D, Tanasie G, Tatu C, Nistor D, Bunu C, Paunescu V. In vitro characterization of tumor-associated fibroblasts as supportive network for cancer development. International Immunology 2010, 22 (suppl.); 167 – 14th International Congress of Immunology, Kobe, Japan.
9. Bojin F, Gavriliuc O, Tatu C, Tanasie G, Tatu C, Nistor D, Crisnic D, Boleman A, Bunu C, Paunescu V. Adipogenic differentiation pathway – gene expression profile. Fiziologia – Physiology, 2010; supplement, Vol. Rezumate, National Conference of the Romanian Society of Physiological Sciences, June 2-5, 2010, Oradea, Romania, pg. 33.

Florina Bojin. Adipocitele – modele de diferenţiere in vitro. Editura Eurostampa, Timişoara 2010, ISBN 978-606-569-139-1

1. Bojin FM, Gavriliuc OI, Cristea MI, Tanasie G, Tatu CS, Panaitescu C, Paunescu V. Telocytes within human skeletal muscle stem cell niche. J Cell Mol Med. 2011; 15(10):2269-2272.
2. Bojin FM, Gruita AT, Cristea MI, Ordodi VL, Paunescu V, Mic FA. Adipocytes Differentiated In Vitro from Rat Mesenchymal Stem Cells Lack Essential Free Fatty Acids Compared to Adult Adipocytes. Stem Cells and Development. 2011, doi:10.1089/scd.2011.0491
3. Oana I. Gavriliuc, Florina M. Bojin, Adriana Rosca, Calin A. Tatu, Virgil Paunescu. Silencing of the Her2 Gene by RNA Interference Inhibits Proliferation of Breast Cancer Cell Line SK-BR3. Fiziologia-Physiology, 2011, vol. 21, nr. 3 (71), pg. 4-9. ISSN 1223-2076
4. Florina Bojin, Oana Gavriliuc, Valentin Ordodi, Mirabela Cristea, Simona Anghel, Carmen Tatu, Gabriela Tanasie, Carmen Panaitescu, Virgil Paunescu. Controversies Related To Cell Cultures Obtained From Various Tissular Samples. Fiziologia-Physiology, 2011, vol. 21, nr. 4 (72). ISSN 1223-2076
5. Bojin F, Tatu CA, Gavriliuc O, Gruia A, Tanasie G, Tatu C, Cristea M, Ciuculescu F, Tocut A, Crisnic D, Carabineanu A, Nistor D, Bunu C, Paunescu V. Stromal cells – tumor microenvironment interactions – Part I. Fiziologia-Physiology, 2010, vol. 20, nr. 1 (65), pg. 37-41. ISSN 1223-2076
6. Bojin F, Tatu CA, Gavriliuc O, Gruia A, Tanasie G, Tatu C, Anghel S, Cristea M, Ciuculescu F, Tocut A, Crisnic D, Carabineanu A, Nistor D, Bunu C, Paunescu V. Stromal cells – tumor microenvironment interactions – Part II. Fiziologia-Physiology, 2010, vol. 20, nr. 2 (66), pg. 31-36. ISSN 1223-2076
7. Bojin F, Ordodi V, Anghel S, Gruia A, Gavriliuc O, Georgescu R, Vintila R, Tatu C, Bunu C, Tanasie G, Paunescu V. Mesenchymal stem cells admix with biological scaffolds heal bone defects in rat model. Romanian Biotechnological Letters, ISSN 1224-5984.

1. ”Tineri Cercetători – cu experienţă” cu ocazia The XXVth National Conference of Romanian Society of Physiological Sciences, 26-28 May 2011, Tg. Mures, Romania, lucrarea cu titlul „In vitro adipogenic differentiation pathway”
2. ”Grigore Ghyka” – Clinical Immunology prize for “Adipocytes-induced changes in tumor microenvironment and cancer cells behavior” poster presentation in Joint Meeting Immunology and Clinical Allergology, 28 April-1 May 2010, Sibiu, Romania