Tehnici de bioimprimare 3D pentru generarea constructelor tisulare care mimează micromediul tumoral (DeLIMIT) – 100PED/03.01.2017 

Perioada de desfășurare: 03 ianuarie 2017 – 30 iunie 2018 

Coordonator: Spitalul Clinic Județean de Urgență „Pius Brînzeu” Timișoara – OncoGen

Partener: Universitatea de Medicină și Farmacie „Victor Babeș” Timișoara

Obiective: Obiectivul specifc urmărit în prima etapă de implementare a proiectului DeLIMIT a fost generarea sferoizilor tumorali de cancer mamar și de colon, realizarea sferoizilor multicelulari prin bioimprimare 3D și caracterizarea in vitro a modelelor tumorale.  Obiectivul specific al etapei a doua a proiectului a fost validarea in vivo a modelului tumoral optim realizat prin bioimprimarea 3D, care a cuprins evaluarea in vivo a evoluţiei modelelor tumorale obţinute prin bioimprimare 3D şi modelarea / simularea computaţională a rearanjării celulelor după biotipărire.

Rezumatul proiectului:

În acest proiect, ne propunem să realizăm constructe tisulare tridimensionale (3D) care mimează micromediul tumoral. Acestea vor include un sistem multicelular, a cărei structură va fi similară tumorii, respectiv un înveliş de celule încorporate în matrice extracelulară, care reprezintă vecinătatea tumorii.

Pentru a le asambla, vom dezvolta metode de biotipărire tisulară 3D, metodă ce aparţine ingineriei tisulare. Vom construi modele 3D ale unor tumori aflate în mediul lor şi le vom valida, caracterizându-le din punct de vedere morfologic, fenotipic, genotipic şi funcţional. Ne propunem să utilizăm două surse celulare: linii celulare standard, precum şi celule primare. Prima opţiune e mai reproductibilă, iar a doua are şanse mai mari de a furniza modele tumorale mai realiste. Pentru fiecare tip celular, vom testa două metode de asamblare asistată de calculator: biotipărirea unor hidrogeluri cu conţinut celular aflat în suspensie, şi biotipărirea unor agregate celulare. Prima metodă asigură o rezoluţie mai bună, iar a doua conduce la o densitate celulară mai mare. 
Modelele tumorale obţinute vor fi validate pe şoareci immunosupresați. În prealabil biotipăririi, celulele maligne şi fibroblastele peritumorale vor fi transfectate stabil cu GFP, astfel încât tumorile vor putea fi vizualizate prin microscopie fluorescentă in vivo. De asemenea, constructele tisulare vor fi ierarhizate în funcţie de abilitatea lor de a mima comportamentul secretor al tumorilor in vivo. 

În urma validării, rezultatele proiectului vor fi aplicabile în studii ale terapiilor cancerului: modelele tumorale 3D vor fi utilizabile pentru testarea personalizată a eficienţei unor agenţi farmacologici, în studii ale evoluţiei tumorale, precum şi în studii care urmăresc transferul rezultatelor in vitro și in vivo în studii clinice, în contextul larg al terapiilor antitumorale.  

Rezultate:

Am validat metodologia de bioprintare 3D a modelelor tumorale in vitro, folosind 3 tipuri celulare distincte, din mediul peri-tumoral (TAF și limfocite T) și celule tumorale; Au fost validate in vitro 2 modele tumorale distincte: modelul triplustratificat și modelul torsional; Am validat in vivo modelul tumoral bioprintat 3D triplustratificat pe șoareci imunosupresați CD1 Nu/Nu; validarea dezvoltării tumorale a fost făcută in vivo cu ajutorul sistemului de imagistică Hamamatsu Aequoria System (cuantificarea dezvoltării tumorale), iar ulterior explantării tumorale s-a efectuat validarea modelului in vitro, prin evidențierea distribuției celulare și expresia markerilor caracteristici; A fost validat modelul computațional de simulare a dezvoltării tumorale.

• Procedeu experimental de realizare in vitro a unor sferiozi tumorali (Fig. 1)
• Metodă de biotipărire a modelelor tumorale toroidale (Fig. 2A) şi triplu-stratificate (Fig. 2B-D)
• Procedeu de cultivare in vitro a modelelor tisulare biotipărite (Fig. 4)
• Procedeu de cultivare in vivo a modelelor tisulare prin implantare subcutanată în şoareci imunosupresaţi (CD1 Nu/Nu) (Fig. 5)
• Programe G-code pentru bioimprimarea modelelor tisulare reprezentate în Fig. 2
• Modele computaţionale de rezoluţie celulară a structurilor tisulare şi programe de simulare a evoluţiei acestora (Fig.3)

Paricipare la manifestări ştiinţifice:

1. Neagu A, Bojin F, Bejenariu MI, Neagu M, Cristea A, Popescu R, Păunescu V. 3D bioprinting techniques for building model tissues” – prelegere orală, a 29-a Conferinţă Naţională a Societăţii Române de Fiziologie, 25 – 27 mai 2017, Timişoara.
2. Bojin F, Neagu A, Bejenariu MI, Cean A, Popescu R, Neagu M, Cristea A, Păunescu V. “3D bioprinting techniques for building model tissues that mimic the tumor microenvironment” – prelegere orală, BIOFABRICATION 2017 International Conference on Biofabrication, 15-18 octombrie 2017, Beijing, China. mai importante realizări din prima etapă de implementare a proiectului.
3. Bojin F, Bejenariu MI, Robu A, Cean A, Popescu R, Neagu M, Gavriliuc O, Neagu A, Păunescu V. “Bioprinted models of the tumor microenvironment: in vivo evaluation and computer simulations” – prelegere orală, BIOFABRICATION 2018 International Conference on Biofabrication, 28-31 octombrie 2018, Würzburg, Germania.
4. Neagu A, Brakke K, Robu A, Bejenariu MI, Koudan E, Bulanova E, Parfenov V, Hesuani Y, Kharin A, Timoshenko V, Mironov V, “Sacrificial multicellular spheroids (sacrospheres) for the biofabrication of tubular tissue constructs”, poster, BIOFABRICATION 2017 International Conference on Biofabrication, 15-18 octombrie 2017, Beijing, China.

Articole in extenso:

1. Neagu A. (2017) Role of computer simulation to predict the outcome of 3D bioprinting. Journal of 3D Printing in Medicine 1(2):103-121.
2. Robu A, Robu N, Neagu A. (2018) New software tools for hydrogel-based bioprinting. Proceedings of SACI 2018, IEEE 12th International Symposium on Applied Computational Intelligence and Informatics, May 17-19, 2018, Timisoara, Romania. – articol in extenso publicat în volumul de Proceedings al conferinţei (DOI: 10.1109/SACI.2018.8440971).