Transfer Tehnologic

Prototipuri CAR-NK

Prototipuri dezvoltate în cadrul proiectului CAR-NK

Celule modificate genetic în cadrul proiectului: Oncoimunoterapii cu celule Natural Killer purtătoare de receptori chimerici de antigen (CAR-NK)

  • Celule NK92 transduse cu vector care co-exprima un construct CAR CD64-2A si interleukina 2 capabile sa produca IL2, devenind  astfel independente de prezenta interleukinei
  • Celule NK92 transduse cu vector care co-exprima un construct CAR CD64-2A si interleukina 15 capabile sa produca IL15, devenind astfel  independente de prezenta interleukinei exogene.
  • Celule NK92 transduse cu receptori CAR anti-CD19
  • Celule K562 transduse sa exprime antigenul CD19, pentru testarea receptorului CAR anti-CD19
  • Dezvoltarea de celule NK purtatoare de constructe CAR universale ce pot media raspunsul citotoxic prin anticorpi monoclonali permite un nivel crescut de flexibilitate al tratamentelor celulare adoptive.

Constructe de tip CAR (receptor himeric de antigen) care recunosc antigenele CD19, EGFR și PD-L1, inserate în plasmide de tip lentiviral și împachetate în particule lentivirale care pot fi folosite pentru obținerea unor celule de tip CAR-NK sau CAR-T.

 
Domeniu de legare a antigenului Domeniu balama Domeniu transmembranar

Domeniu

co-stimulator

Domeniu stimulator/citotoxic
CD19 CD8a NKG2D NKG2D CD3Z
CD19 CD8a NKG2D DAP10 CD3Z
CD19 CD8a NKG2D DAP12 CD3Z
CD19 CD8a NKp46 NKp46 CD3Z
CD19 CD8a CD8a 41BB CD3Z
CD19-myc CD8a CD8a 41BB CD3Z
CD19-myc CD8a CD28 CD28 CD3Z
EGFR CD8a CD8a 41BB CD3Z
PDL-1 CD28 CD28 CD3Z

Tabel 1. Constructe CAR care recunosc antigenele tumorale CD19, EGFR și PD-L1 ce conțin diferite domenii transmembranare și co-stimulatorii specifice celulelor NK

Harta unui vector lentiviral indicând regiunile funcționale ale vectorului și domeniile relevante ale constructului CAR

Activitatea citotoxică a celulelor NK-92 transduse cu un construct CAR anti-CD19 a fost evaluată prin determinarea citolizei observată ca urmare a punerii în contact a celulelor efectoare cu celule țintă tumorale marcate fluorescent. În acest scop, au fost utilizate drept țintă celule tumorale aflate în suspensie CD19- (U266) sau CD19+ (NALM6). Astfel, s-a putut observa că celulele transduse distrug specific, în proporție semnificativ crescută (**, p=0.0031) celule tumorale CD19+ NALM-6.

Teste de citotoxicitate cu celule NK-92 netransduse sau transduse cu CAR anti-CD19 față de celule țintă care exprimă sau nu antigenul CD19. În panelul superior este determinată expresia antigenului CD19 prin citometrie în flux.

Constructe CAR universale care conțin un modul de legare al receptorului de imunoglobuline de mare afinitate FcγRI (CD64), ce pot media răspunsul citotoxic prin anticorpi monoclonali cu diferite specificități

Domeniu de legare a antigenului Domeniu balama Domeniu transmembranar

Domeniu

co-stimulator

Domeneiu stimulator/citotoxic
CD64 CD64 CD64
CD64 IL2RG Il2RG
CD64 FcRG FcRG
CD64 CD16A CD16A
CD64 CD16B
CD64 CD8a CD8a 41BB CD3Z
CD16A-158 CD8a CD28 CD28 CD3Z

Tabel 2. Constructe CAR cu modul de legare de tip receptor Fc

Aceste CAR-uri universale se bazează pe folosirea domeniului extracelular al receptorului de mare afinitate al domeniilor constante Fc ale imunoglobulinelor IgG (CD64), și diferite module transmembranare și intracitoplasmatice. Utilizarea acestor CAR-uri bazate pe domeniul extracelular al receptorilor Fc de mare afinitate permite „armarea” celulelor NK sau T cu diverși anticorpi monoclonali sau module proteice ce recunosc antigene specifice, cuplate cu domeniul Fc, conferind acestor celule flexibilitatea de a fi personalizate (folosite împotriva diverselor antigene). În plus, specificitatea acestor celulele modificate genetic poate fi optimizată prin conjugarea cu anticorpi multipli, creând astfel celule cu specificități multivalente. Folosirea unui schelet comun, CD64 sau un epitop comun de tip eticheta (myc-tag), în construcția acestor receptori himerici, permite, în plus, detecția cu ușurință a expresiei acestora pe suprafața celulelor modificate genetic.

Pentru a demonstra funcționalitatea receptorilor CAR universali care pot lega molecule de anticorpi cu potențial terapeutic, am efectuat un test de citotoxicitate față de celule Raji care exprimă antigene CD20 și CD19 cu celule NK-92 netransduse sau transduse cu CAR anti-CD19 sau CAR care conțin module de legare de afinitate crescută de tip CD16(F158V) sau CD64, în absența sau prezența anticorpilor anti-CD20 terapeutici de tip IgG1, Rituximab.

Determinarea activității citotoxice față de celule Raji (CD19+CD20+) în prezența sau absența anticorpilor anti-CD20 a celulelor NK-92 netransduse și transduse cu diferite constructe tip CAR, anti-CD19 sau de tip universal. Raportul dintre celulele efectoare și cele țintă a fost de 3:1.

Vectori lentivirali cu constructe CAR care co-exprimă interleukine și permit multiplicarea și supraviețuirea celulelor NK-92 in vitro independent de citokine exogene.

Vectorii care exprimă un construct CAR universal de tip CD64 și interleukina 2 sau 15 de pe același vector au fost împachetați în particule lentivirale și folosiți pentru transducția celulelor NK-92. Celulele care exprimă IL-15 au demonstrat capacitate de autoselecție și proliferare în absența IL-2 în mediul de cultură.

Brevete rezultate în urma proiectului CAR-NK

  1. Bojin MF, Gavriliuc OI, Tanasie G, Tatu CA, Panaitescu C, Paunescu V, Nedea CE. „Celule selective bispecifice CAR-T pentru tratamentul tumorilor solide și metodă de obținere”, nr. A/00704/2020, data depozit 06/11/2020, Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci (OSIM), Direcția de brevete de invenție și informații tehnologice.
  2. Nedea CE, Paunescu V, Gavriliuc OI, Zogoreanu R, Ivan A, Cristea IM, Tatu CA, Bojin MF, Anghel SS. „Celule citotoxice purtătoare de receptori himerici de antigen universali care țintesc antigene diverse și multiple pentru tratament adoptiv”, nr. A/00705/2020, data de depozit 06/11/2020, Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci (OSIM), Direcția de brevete de invenție și informații tehnologice.

 

Publicații rezultate în urma proiectului CAR-NK

  1. Szekely FAE, Zogorean R, Anghel S, Gavriliuc O, Bojin F, Paunescu V. CAR-T cells therapy versusTILs therapy: the future of cancer immunotherapy. Fiziologia-Physiology 2018; Vol. 28, No. 1(95): 4-15.
  2. Zogorean R, Gavriliuc O, Bojin F, Paunescu V. Real-time imaging of NK-92 cells interaction with tumoral cell lines. Fiziologia-Physiology2018; Vol. 28, No. 2(96): 4-9.
  3. Szekely F, Zogorean R, Anghel S, Paunescu V. CAR-NK cell-based therapy: an era of a new potential immunotherapy. Fiziologia-Physiology2019; Vol. 29, No. 1(97): 13-21.
  4. Popa L, Crisnic D, Nistor D, Plesca D, Tatu C, Tanasie G, Zogorean R, Gavriliuc O, Anghel S, Bojin F, Paunescu V. Modern application of Next-Generation Sequencing (NGS). Fiziologia-Physiology2019; Vol. 29, No. 2(98): 9-16.
  5. Plesca D, Crisnic D, Nistor D, Tatu C, Tanasie G, Zogorean R, Anghel S, Gavriliuc O, Bojin F, Paunescu V. Fiziologia-Physiology2019; Vol. 29, No. 2(98): 38-43.
  6. Olteanu GE, Mihai IM, Bojin F, Gavriliuc O, Paunescu V. The natural adaptive evolution of cancer: The metastatic ability of cancer cells. Bosn J Basic Med Sci., 2020; 20(3): 303-309.
  7. Zogorean R, Anghel S, Gavriliuc O, Paunescu V. Cryopreservation of Natural Killer Cells. Fiziologia-Physiology2020; Vol. 30, No. 1(99): 24-28.
  8.  Olteanu GE, Crisnic D, Grijincu M, Cristea M, Zambori C, Ivan A, Gavriliuc OI, Bojin MF, Paunescu V, Nedea E. Assessment of cell culture media variation inducing cytokine secretion in PBMCs, CD3+, and CD8+immune cells. Fiziologia-Physiology2020; Vol. 30, No. 1(99)

*Articolele identificate la pozițiile 5 si 8 au fost realizate în cooperare cu entități private.